高保真DNA聚合酶原來是這樣的
更新時(shí)間：2018-11-08 點(diǎn)擊次數(shù)：2174
高保真DNA聚合酶的保真性：保真性是Taq酶的52倍，Pfu酶的6倍。*的擴(kuò)增能力：簡(jiǎn)單模板可擴(kuò)增20 kb，復(fù)雜模板可輕松擴(kuò)增10 kb。*的靈敏度：模板親和力強(qiáng)，極微量的模板也可擴(kuò)增。風(fēng)一樣的擴(kuò)增速度：延伸時(shí)間極短，擴(kuò)增速度可達(dá)15 sec/kb。廣泛的模板適應(yīng)性：適用于基因組DNA和cDNA等復(fù)雜模板的擴(kuò)增。在PCR實(shí)驗(yàn)中使用適當(dāng)?shù)木酆厦笇⒋_保佳的產(chǎn)量和特異性，目前市場(chǎng)上聚合酶甚多，如何選擇，有時(shí)還真是個(gè)難題。廠家一般都會(huì)提供一個(gè)選擇指南，列出每個(gè)產(chǎn)品的特異性、保真度、產(chǎn)量等。保真度是實(shí)驗(yàn)成功關(guān)鍵的因素之一，不可不重視。 具體來說，這涉及到多個(gè)步驟，包括讀取模板鏈，選擇正確的三磷酸核苷，并將此核苷酸插入3’引物末端的能力。為了區(qū)分正確和錯(cuò)誤的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。這種“校正”活性可切除不正確摻入的單核苷酸，并將其替換成正確的核苷酸。高保真PCR使用摻入錯(cuò)誤率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保證目的DNA的忠實(shí)復(fù)制。
在設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，你首先要考慮你的應(yīng)用是否需要高保真DNA聚合酶。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果依賴于正確的DNA序列（如克隆或測(cè)序）那么你就要盡量減少錯(cuò)配核苷酸的摻入。而對(duì)于普通PCR或菌落PCR，確定擴(kuò)增子是否存在或質(zhì)粒上是否帶有插入片段，那高保真則大可不必。由于某些高保真DNA聚合酶的強(qiáng)勁特性，一些研究人員在所有擴(kuò)增中都使用它們。
高保真DNA聚合酶如何測(cè)定保真度，廠家通過各種不同的方法來確定DNA聚合酶的保真度，使用M13噬菌體的部分lacZα基因，通過宿主菌落顏色的變化來檢查DNA合成中的錯(cuò)誤。利用PCR來復(fù)制整個(gè)lacZ基因和兩個(gè)抗藥性基因的一部分，隨后連接、克隆、轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選。若lacZ基因存在錯(cuò)誤，則破壞β-半乳糖苷酶活性，導(dǎo)致白斑的出現(xiàn)。通過這些實(shí)驗(yàn)方法，白斑克隆的比例可轉(zhuǎn)化為錯(cuò)誤摻入的數(shù)量。Sanger測(cè)序則提供了保真度的更直接讀取，可檢測(cè)所有突變。利用這種方法可確定聚合酶的整個(gè)突變譜。
關(guān)于高保真DNA聚合酶的高保真，目前還沒有統(tǒng)一的定義。人們往往與Taq DNA聚合酶比較，來判斷保真度的相對(duì)高低。利用Taq以25個(gè)PCR循環(huán)擴(kuò)增400 bp的片段，可能一半的克隆都帶有錯(cuò)誤。對(duì)于較大的片段如1 kb，每個(gè)克隆都可能帶有不想要的突變。相比之下，NEB的Q5超保真聚合酶的錯(cuò)誤率比Taq低100倍。根據(jù)這一數(shù)據(jù)，200個(gè)克隆中的199個(gè)將是正確的。
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